实时荧光定量PCR仪发展早期就是运用最简单的方法

利用包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了乾净的包含体，再对包含体溶解复性。这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使後面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。 

荧光化学：目前 real2time Q2PCR 所使用的荧光化学方法主要有五种 ,分别是:DNA 结合染色 ,水解探针 ,分子信标 ,荧光标记引物 ,杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。 扩增序列非特异性检测方法的基础是 DNA 结合的荧光分子 ,如 SYBR green 1[3 ] 等荧光染料。Real2time Q2PCR 发展早期就是运用这种最简单的方法 ,在 PCR反应体系中 ,加入过量 SYBR green 1 荧光染料 ,SYBR green 1 荧光染料特异性地掺入 DNA双链后 ,发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何 dsDNA序列的扩增 ,不需要探针的设计 ,使检测方法变得简便 ,同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合 ,因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合 ,使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线(melting curve)分析的软件加以解决。扩增序列特异性检测方法是在 PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物 ,它又可分为直接法和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策略[4 ]。目前在real2time Q2PCR中最广泛使用的 TaqMan 系统就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针 ,该探针为一寡核苷酸 ,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团 ,此时 5’ 端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的 3’ 端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移 ,FRET) ,因此探针完整时 ,检测不到该探针 5’ 端荧光基团发出的荧光。但在 PCR 扩增中 ,溶液中的模板变性后低温退火时 ,引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下 ,沿摸板向前延伸至探针结合处 ,发生链的置换 ,Taq酶的 5’- 3’ 外 切酶活性(此活性是双链特异性的 ,游离的单链探针不受影响)将探针 5’ 端连接的荧光基团从探针上切割下来 ,游离于反应体系中 ,从而脱离 3’ 端荧光淬灭基团的屏蔽 ,接受光刺激发出荧光信号 ,即每扩增一条 DNA 链 ,就有一个荧光分子形成 ,实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步

西安天隆科技有限公司是专业生产研发ATP荧光检测仪、、核酸提取仪、核酸纯化仪、PCR仪、