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血细胞分析仪在光学仪器发展中的技术进步

发布于:2018年11月17日 来源:www.fuhai360.com
[摘要]随着各种技术的不断进步以及西安光学仪器设备需求的不断增加, 血细胞分析仪的各项用途和用法也有不断的进展,这首先体现在仪器应用的方便性,准确性和尽可能增加的参数上.
    随着各种技术的不断进步以及设备需求的不断增加, 血细胞分析仪的各项用途和用法也有不断的进展,这首先体现在仪器应用的方便性、准确性和尽可能增加的参数上。
    1、稀释技术的进步: 早期的仪器一般要求在测定前先进行人工稀释,因此许多操作要求直接取20~40ul 的末梢血加到稀释液中。白细胞稀释比例多在1:251 和1:501倍,红细胞则需要进行二次稀释, 稀释倍数在6.25~25万倍之间, 然后再将稀释好的标本放入计数杯内进行计数,而且需要在白细胞稀释悬液中加入溶血剂。由于人工稀释费时费力且精确性差,随后的一些血细胞计数仪增加配置了专用的稀释器, 专供该型号的仪器进行机外稀释,这样减少了人工稀释带来的误差和麻烦,提高了效率。这类仪器的典型例子有国内应用非常普遍的SysmexF820 型, 此型号仪器到目前仍有市场需求并在广泛使用。现代的血细胞分析仪则更加先进,已经将自动稀释技术,自动进样方式全部添加到仪器本体内,即提高了技术含量、取样和稀释的精确度,使得进样的速度和可操作性更加方便,同时使得检测速度加快。

    2、分析参数的增加:前面谈到早期的血球计数仪仅能进行红白细胞计数, 而且是需要通过切换分别进行红白细胞得计数, 所以将其称为血细胞计数器是恰当得。由于血常规检验对血红蛋白测定的需求增加,沙利比色法由于精度和操作不便不能满足临床需求,已经有单独的血红蛋白比色计配备,将加入专用的溶血剂后的样本进行白细胞计数后再将其倒入血红蛋白比色计, 即可得到比色法测定的血红蛋白结果。此时期国内使用最多的血细胞计数仪是Coulter ZF 型和血红蛋白计。由于对血红蛋白测定要求的增加,因此在仪器内增加一套比色装置,就可方便的测定血红蛋白。电阻法定细胞数量的同时还可对细胞体积进行测定,因此对红细胞平均体积(MCV)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)测定和计算也成为血球计数仪的标准参数。1975 年日本东亚公司(TOA, Sysmex 的前身) 推出了包含以上7 个参数的全自动血细胞计数仪器CC-710 和CC -720 型。

西安光学仪器

    3、血小板计数功能的增加:血小板是血细胞中最小的粒子,早期的血细胞计数仪均不包含血小板计数。60 年代起国外开始研制血小板计数仪,70 年已经有比较成熟的产品,这类仪器一般需使用PRP 血浆进行, 即使用特殊的离心速度将红细胞和白细胞进行沉淀,使上层血浆中尽量保存最为丰富的血小板,然后应用这种PRP 血浆进行血小板计数,例如Sysmex PA-701 型和CONTRAVE 1000 型,此类仪器多配有专用PRP 离心机。使用全血方式和水动力聚集方式计数血小板的仪器如Clay-Adams 的Ultra-Flo100 型以及80 年代后出现在我国的Baker S-810 型血小板分析仪,该仪器设定了单独血小板分析测量通道,根据红细胞和血小板体积的显著差异他们区分开,将血小板按体积大小划分到64 个通道,分别累加体积大小不同的血小板数量。它通过直接吸入稀释好的血细胞悬液进行测定,除了给出血小板数量外,还提供了两个新的参数,平均血小板体积(MPV) 和血小板体积分布宽度(PDW)。在这之后血细胞分析仪将血小板计数这一重要功能合并到全血细胞计数(CBC) 范围内。当时的仪器有很多型号,例如Baker 8000, Sysmex CC-800,Coulter S 系列和T 系列等。
    4、定量部的改进:仪器为了准确进行细胞计数,除了要准确稀释血液外, 对直接进入计数小孔内的液体量也要进行定量控制,因此仪器对定量部的要求是非常严格的。在血细胞计数仪开始阶段, 人们设计了U型水银管压力计,通过水银的重量和在两个电极间的距离来控制吸入的标本量。后来人们通过两只光电管来了解液体通过一个固定距离所需要的时间和容积来控制标本的吸入量,还有一些公司设计并使用了微量注射器技术以及浮球定量技术来控制计数样本的量。最新的光电计时容量控制技术控制标本进入计数区的量,可以使得进入计数区域的细胞悬液定量更加准确和无污染、同时还可判断小孔是否出现堵塞或半堵塞问题,以及便于维护。
    5、自动取样技术: 由于仪器需要对全血进行自动取样和稀释, 因此取样量也同样需要精确控制。最初的仪器是需要进行手工取样和稀释的,后来逐渐有了外置式专用取样稀释器。再后来仪器内部设置了内置式负压取样稀释器,根据负压量的大小来吸取血液样品,这对控制负压的精确度要求很高,此外还有微量注射器取样技术,依靠光电管控制血液取样量的技术等。目前认为采用旋转阀取样技术是比较精确的方法,旋转伐内部有多个按一定体积设计的小孔,当血液进而后,旋转伐从吸入的小孔转向排出的小孔,此时血液不能再进入,而孔内保留的固定量的血液进入仪器的稀释部,然后清洗,再进入下一次循环。目前许多更加先进的血液分析仪均采用陶瓷制的旋转阀来分配血液标本。
    进样方式也从最初的单一预稀释方式,演化为预稀释和全血方式两者兼有。现在许多先进的五分类血液分析仪还采用了更多种进样方式,例如Sysmex XE-2100 和Bayer Advia 120 型,如末梢血方式、开盖手工进样、闭盖手工进样、急诊检验进样、全自动进样等方式以及连接到全自动流水线的自动进样技术等。进样设备有的采用旋转式进样盘,如MEDONIC CA570和SWELAB AC920/970, 这种旋转式进样器多是选配件。更多的血液分析仪采用了平推式的自动进样系统,即将待检样品插在专用试管架上,仪器将试管架一步步送入仪器的取样口,测定完毕后自动推出。平推式自动进样系统在有些厂家的仪器上是可选择的配件,而在某些仪器上则是必备件。
    5、仪器的清洗技术:最初的仪器的清洗靠人工浸泡或使用毛涮清洗,如果测定完一个很高值的标本,则需要用空白液清洗一下,以防止对下一个标本的携带污染。而现在许多仪器在完成一个标本的检测后可自动对计数小孔、管道进行冲洗,还可同时对取样器、稀释器、取样针内外进行全面清洗,减少交叉污染的机会。许多仪器在开机和关机时可自动执行清洗程序或按事先设定的清洗程序进行定时清洗,保证仪器正常工作。
    6、小孔管技术的改进:小孔管是血细胞分析仪进行计数的关键部件,早期的仪器一般仅有一个直径为100μ的小孔管,多使用宝石经过激光精确打孔,然后镶嵌再玻璃支撑物上。现在多数电阻法仪器的小孔管在白细胞检测上使用直径为100 μ的小孔管,在红细胞和血小板检测上使用直径为60~ 80μ的小孔管,材料有宝石和特殊陶瓷等构成。例如经典的COULTER 外置式小孔管,当发生堵孔时可用毛刷清理或直接拆下来清洗。早期的小孔管一般暴露在外边,其主要目的是便于人工清洗,多为单管方式,进行白细胞到红细胞计数转换时最好清洗一下。后来发展为红细胞和白细胞各自独立的两个暴露在外的小孔管,一般20秒即可同时完成红细胞和白细胞的计数,需人工使用加样器或定量吸管从白细胞稀释悬液中进行红细胞的二次稀释或使用配套的稀释器。目前的仪器小孔一般采用内置式,减少了污染的机会并同时提供了自动清洗功能,使得每次计数后都能提供自动冲洗,减少了交叉污染的机会同时计数的速度也有了很大提高。
    为了更加准确的对细胞计数和防止各种干扰发生,各在小孔管的改进和设计上使用了不同的处理方案。这些技术有力的保证细胞计数准确,特别是血小板计数的准确性。
  (1)扫流技术(Sweep Flow): 为减少已通过计数小孔后由于液流的回流而重新返回计数区造成重复计数,在小孔后面增加一个扫流液系统,将计数过的细胞通过扫流液冲进废液管道。

  (2)防反流装置(Von Behrens): 为防止细胞返回到计数敏感区,在小孔后面加一个带孔的当板,用负压将已经计数过的细胞阻挡后直接收集到废液管道中。

  (3)水动力聚焦技术(Hydrodinamic Focusing): 是目前认为最为有效的方法,也叫鞘流技术。它利用流体动力学原理,即可保证细胞位于鞘液中心并排成一列通过检测孔中心或通过激光束中心,又保证它不会返回敏感区,目前许多较为高级的血液分析仪一般采用此种技术。

7、其他用于保证计数精确性的技术:

(1) 脉冲编辑功能(Pulse Edit): 可防止因细胞未从小孔中心通过而产生的脉冲改变并对其进行技术性修正,以得到准确细胞计数和体积测定结果。

(2) 三次计数技术或多段计数技术(Voting):采用同时进行三次计数取平均值的做法或将总体计数时间分为多段进行统计,如果各段之间差异不大,可直接给出准确结果,如果差异稍大则进行提示或报警,如果差异明显则不给出结果,因而保证了计数结果的质量和准确。

(3) 重叠校正技术(Coincidence Correction):通过仪器的逻辑电路和数学计算以及按照计算公式将重叠校正公式编入仪器的测定程序中,当出现两个细胞同时通过小孔的现象时,仪器就会很容易进行判断、运算处理后将结果校正过来。

(4) 浮动界标技术(Floating Threshold):为保证血小板计数的准确,浮动界标将根据红细胞和血小板分布曲线的交界处寻找最低点,将此点作为红细胞和血小板计数的分界线,这样可以很好的处理过多小红细胞对血小板计数的干扰问题。

(5)拟合曲线技术(Fitting Curve): Coulter公司设计的血小板计数范围是2~20fl, 为排除噪音干扰和小红细胞干扰, 根据正常人血小板体积分布呈对数正态分布的理论, 通过电子曲线拟合将没有被计数的大血小板计算在内,得到既无噪音干扰又无小红细胞影响的准确血小板计数结果。

(6) 延时计数计数(Extended Count):当细胞数少于特定值时,仪器自行重复计数,以保证获取更多的细胞数,以减少统计学误差得到更加正确的结果和直方图形。

8.各种故障处理功能的进展: 任何一台血液分析仪都会有故障,而简单的故障处理方法和程序将给用户带来方便。

(1) 堵孔的处理: 堵孔为最常见原因,在没有处理程序前, 人们是通过毛刷来清洗小孔的。后来仪器设置了自动排堵功能,通过负压或正压,使用清洗剂对小孔的内外进行强力冲洗来排除堵孔。后来发展为燃烧电路,对小孔局部增加高电压,使得堆积在小孔周围的蛋白质等杂质变质和灼烧,然后用清洗液冲洗干净。

(2) 自动报警功能:仪器可在开机或运行期间对仪器本身的温度、压力、液流系统、试剂、电子系统、光路系统等各个需要控制的部件进行监控,一但超过标准或出现故障,仪器可以显示这个故障和记录这个故障,并在手册或软件中增加排除故障的方法介绍。

(3)远程诊断系统:更加先进的设备可以通过Internet 网络和仪器生产厂家在网络上建立联系,可以将你的故障和问题直接传送到仪器厂家的技术支持部门,由他们在网上对仪器进行诊断,提供解决方案,甚至工程师可以通过网络遥控的方式直接排除故障。

(4) 帮助方式:许多仪器设计了很多故障自动诊断和帮助方式。早期的仪器一般是将仪器可能出现的各种故障和解决方法用用户手册的方式提供,目前更先进的方法是仪器可自动提供诊断报警,用符号表达或用文字直接表达, 或按帮助键(help) 后自动列出并提供解决故障的参考方法。而BAYER ADVIA 120 型血液分析仪更将整个操作说明和故障诊断等各项帮助程序存入系统中,可以方便的使用检索方式或链接方式找到各项目的说明和帮助,甚至提供动画方式对原理和仪器维护进行演示,提供各种散点图的模式和介绍。

9、质控程序的进展:血液分析仪需要进行日常质量控制,以监控其测定结果的准确性。早期的血液分析仪一般没有质控程序,是依靠人工记录质控数据,人工绘制质控图。90年代以来由于微机技术的发展,使得包括质控程序在内的许多功能得以在血细胞分析仪上实现。例如浮动均值质控法,自动将符合条件的每20个样本的MCV 、MCH、 MCHC 数值求出均值并储存,最后绘制为浮动均值质控图,如Sebia 的Hemalyser 3 型就有这个功能。近年来的许多仪器都增加了多种质控程序,例如ADVIA 120型血液分析仪和SYSMEX XE-2100 型血液分析仪, 可以将日常质控的多达20组的质控数据储存在机内,或传人相连的电脑处理,甚至通过网络直接发送到厂家的服务器,设备厂商可通过网络直接了解每台设备每天的质控情况,必要时对用户进行指导和对仪器进行校正和检修。

10、仪器校正功能的进展:任何一台血细胞分析仪都需要校正。最早人们需要通过调整设定域值的轮盘, 找到域值曲线最为平坦的部位。随后改进为根据靶值和测定值人工计算出校正因子, 将校正因子输入仪器,也可以在现有的校正系数上增加或减少一定的百分比。现行的校正方法更为方便,可直接将靶值输入仪器,让仪器测定该校正品后自己计算出校正系数并保存,当然这种仪器也可以通过人工直接调整的方法进行校正。

11、用户界面的改进:所谓用户界面就是仪器的使用方式、可操作的或可看见的显示界面和程序。最早的仪器几乎没有什么复杂功能,需要用机械按键的方式选择白细胞计数还是红细胞计数,没有打印和储存,在电子数码管内显示的结果需要手工记录下来, 例如Coulter ZF 型。后来有了接触式按键和小型液晶显示屏以及小荧光屏显示,使得仪器在功能上和使用程序上有了一定的改观,可以选择不同的程序来操作仪器的各种功能和存储打印结果,如Medonic CA570 和CA610,Swelab AC920 等。现在更有一些仪器采用了触摸屏控制方式,使得仪器操作界面更加人性化和更加方便,减少了面板表面的各种控制按键和附加的专用键盘,如日本光电的MEK-6108 和MEK-6318,Coulter 公司的ACT-DIFF 系列仪器,都使用了触摸式荧光屏控制技术。

现行的仪器则使用了更加先进的操作系统化物用户界面,对仪器的整个操作可以在电脑上进行,或者直接采用WINDOWS 的操作系统。仪器的用户界面更加复杂,功能也更加完善,例如Bayer Advia 120 型。许多仪器甚至提供中文操作菜单,非常方便国内用户使用, 或连接中文操作系统支持的电脑软件例如SYMEX KX-21 、日本光电MEK-6318 型等。

12.仪器的打印方式:早期的仪器没有打印机,需人工记录简单的测定结果。当仪器的参数越来越多时,仪器开始配备打印机。有内嵌式打印机、外接式卡片式打印机和卷纸式打印机、电脑联网打印等许多方式,并可以选择多种打印格式,可将预设的参考值和提示字符以及提示语言同时打印。许多仪器多设有标准的RS-232 接口,可将测定结果的数据传到计算机中进行处理和打印。有的仪器本身可依靠自带的硬盘存储大量的数据和图形,如江西TECOM 的TEK-2000,3000 型,更多的仪器采用了匹配的电脑系统来存储患者大量的数据和图形。

13、嗜酸细胞、嗜碱细胞提示或计数功能的加入: 嗜酸细胞和嗜碱细胞提示功能是在白细胞三分类的基础上,应用软件对图形分析后得到的参数,它一般来讲只具有提示含义,例如嗜酸细胞可能高于参考值等。这类仪器的代表产品有Coulter JT-IR 型。而能够对嗜酸细胞进行计数的Swelab AC920EO 系列则采用特殊试剂将嗜酸细胞保护起来,单独进行嗜酸细胞计数,这种方法应该是较早实现仪器对嗜酸细胞直接计数的方法之一,比提示性结果更加可靠。当五分类血液分析仪进入实验室, 单独具有嗜酸细胞计数功能的仪器才无开发的必要和市场需求。

14、其他技术的应用: 多数现行的血细胞分析仪都有标准计算机接口,可与医院信息管理系统进行连接;使用软盘或大硬盘对数据和细胞分析图形进行储存和检索;使用条码技术对标本进行分类和处理;使用全自动进样装置实现全自动化;通过磁卡或条码技术对试剂进行管理;对血细胞分析项目进行有规律的组合和选择等。这些技术的应用给当代血细胞分析仪提供了更加方便的使用方式和良好的管理方式。现代的许多仪器还增加了包括对试剂的管理,试剂消耗、试剂有效期和温度的管理。

15、红细胞分析技术:现行的血细胞分析仪一般可对白细胞进行分群或分类,但是对红细胞的体积大小和每个红细胞内血红蛋白含量的多少进行分析和分群则是更加特殊的技术。早在上世纪80 年代开始Technicon 公司采用激光分析技术制作的血液分析仪就可以做到这些,目前BAYER ADVIA 120 也是唯一可对红细胞的体积和色素含量进行分析的仪器。在测定过程中,仪器的高角度散射光可对每个红细胞内的血红蛋白含量进行测定,低角度散射光可对每个红细胞的体积大小进行测定,通过这两个参数组成的矩阵,可以得到红细胞的九分图,并可进一步得到每个分布区域内红细胞的数量和百分比。红细胞九分图能够更好的表达患者红细胞的体积和色素分布情况,对贫血的诊断和治疗有很大帮助。值得一 提的还有使用UFC 板技术的BAYER ADVIA 120 血液分析仪。该板采用集成的液流系统,将多种管道、电磁阀、反应池、电极等全部集成在一个塑料板内,形成仪器的心脏部件,所有试剂、标本、混合、反应都在板中进行,省去了大量管道和体积大的电磁阀和反应杯,所以样本流动和稀释过程都可从透明板中看到,是所有血液分析仪中唯一独创的技术。该集成液流反应板被称为UFC 板,主要在ADVIA 120 和2120 仪器上应用。

15、应用其他原理的血细胞分析仪:除了我们常见的电阻式血细胞分析仪以外,还有某些特殊原理的仪器简要介绍如下。

(1)激光法:应用单束激光照射到经过壳流技术处理的排列成一列的单个细胞上,根据细胞阻断激光束的频率以及PMT 收集到的激光折射信号,对细胞的数量、体积进行分析的仪器,以Sebia Hemalyser 3 为代表。目前采用激光法的高档血细胞分析仪开始逐渐升温,许多采用电阻法进行血细胞计数分析的仪器同时也添加了,如著名的VCS 技术就是典型代表。它除了可用于细胞计数外,还适用于对白细胞的分类、红细胞分析、血小板分析和网织红细胞分析等。

(2)离心式血液分析仪:将血液充入到含义特殊试剂的毛细管内,在专用离心机上离心,根据血细胞中各种成份的比重不同而分布在不同的细胞层内的原理,血细胞被吖啶橙染色,各细胞层会有明显的颜色差异,然后将毛细管放在特殊的判读机上对不同的细胞层进行定 量分析,可得到红细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板、血红蛋白等的参数。该仪器适合于携带, 并且不需要液体试剂,非常方便于外出使用, 适合于仅需要对红白细胞、血小板、血红蛋白以及中性粒细胞和淋巴细胞计数等常用参数的分析,这种仪器有B-D 公司生产的QBC 型。

(3)移动光学法:早期的光学法血细胞计数仪器, 采用普通光源,血细胞在移动过程中被检测到,不能分析细胞的大小和内部结结构,因此仅可进行红细胞和白细胞的计数,本文在开始部分就做了简易介绍的英国EEL 就是典型代表,现在已经停产。