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克隆基因的酶切位点问题
1 对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识不赘述。这里对NdeI和HindIII为例。
2 设计PCR引物时的保护碱基数目。这可能是初涉入未引起注意与重视问题。NdeI需加入6个以上的保护碱基，而HindIII则要三个就可以。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类。
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
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