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质粒构建详细步骤：
1. 通过PCR扩增目的基因片段
PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。
2. 酶切 根据引物设计的酶切位点，分别对PCR产物和质粒载体进行酶切，酶切后的产物也要进行回收
3. 连接通过连接酶将酶切后的PCR产物和质粒载体进行连接
4. 转化将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a），涂板，培养过夜
5. 挑取单克隆，并鉴定挑去平板上的单克隆培养，可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序
如果是需要把一个特定的基因片段扩增后，插入到载体上构建质粒，则要根据载体上多克隆位点带有的酶切位点，在自己的目标基因片段上下游都分别设计一段序列，并在设计的序列中引入载体上的酶切位点。这个时候设计出来，用于完成PCR扩增，并能够在目标序列上下游都引入酶切位点的两段序列就叫做质粒构建引物。
这样扩增获得的目标片段两端就带有了酶切位点，经过酶切后，与同样经过酶切的载体就可以连到一起，形成环状，完成质粒的构建。
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