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现有外源基因表达系统主要包括:细菌、丝状真菌、酵母、哺乳动物细胞、动物乳腺、昆虫(昆虫细胞、昆虫杆状病毒和昆虫整体)和植物表达系统(植物整体、病毒载体和油体)等。这些外源基因表达系统在表达量、表达产物的分离纯化及活性、成本等方面各有优缺点。从近年的研究进展看,利用植物表达系统大规模生产各种目的蛋白还受到诸多因素的限制,表达量低、提取和纯化成本高是主要的限制因素。植物油体表达体系将目的蛋白的编码基因插入油体蛋白(oleosin)编码基因的3`端,以oleosin启动子驱动目的蛋白与oleosin一起在转基因植物的油体中特异表达,获得转基因植物种子后,将种子粉碎, 利用油体的疏水性,离心将油相和水相分开,回收上层油体部分,即可去除种子中大部分的非目标成分,从而显著降低目的蛋白的分离纯化成本,因此近年来倍受关注。作为一种新型的植物生物反应器,为最终利用转基因植物生产外源蛋白提供了新的途径。
1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列,查阅相关文献,看目的基因在那些细胞或者组织中高表达,进而设计该基因的引物,扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取
2 构建表达载体:根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达,这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒,导入表达系统中。一般原核表达时间短,成本低,表达量大,常优先考虑;但是有些基因在E coli中就是表达不出,可能是密码子优化等出现问题,也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑(原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好),有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。(我手里就有相关资料,因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备),这一步再强调一下,优化密码子对于蛋白的成功表达很重要
3 载体构建好了,下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂,诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题,即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下,取菌体上清(分泌型)或者破碎细胞(胞内表达的蛋白)电泳,看是否得到目的分子量大小的蛋白
4 蛋白表达成功,下面是根据蛋白质本身亲水/疏水,电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤:离心,取蛋白所在的相
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