深圳科软KR仿手工甩干式不堵孔洗板机之对硫磷直接免疫测定方法

       不吸液：删除吸液针等吸液系统，利用旋转和重力去液。

       无污染：水平放板，旋转向下甩液，保证最大程度去液。独特锅底状接液设计，极难反溅。独有的防污染预处理洗板程序。

       免拍板：微孔内无残留，洗好后不用人工拍板。免除拍板给环境和使用者造成的不利影响。

       不堵孔：无吸液针，极大地降低堵孔风险。注液针防堵孔处理，实现注液针不堵孔。闲时管路自动清洗，避免结晶堵塞。开关机自动维护，保证管路内畅通无阻。

       不撞针：注液针不移动，与微孔板保持足够距离，有效保护酶标板和孔内包被。

       可条洗：每块板可以任选条数进行清洗，节省洗液，保护环境。

       速度快：一次可洗1—6块板，KR306洗好6块板约4分钟。

          对硫磷是一种广谱高效杀虫剂，具有很强的胃毒和触杀作用。我国要求一些农产品中最大允许残留量应小于0.1 m g / k g，而蔬菜和水果上要求不得检出。下面介绍对硫磷直接免疫测定方法。
(一）对硫鱗免疫抗原的合成
       ① 氨基-对硫磷的合成：取0. 5 g 对硫磷，溶解在5 m L 乙醚中，用冷的l % N a 2C 〇3 溶液反复萃取3 次。在乙醚相中加人5 m L 乙酸-盐酸缓冲液（9 : 1，V / V ),分多次加人锌粉1 g，边加边搅拌，加完锌粉后，升温搅拌回流45 m i n。过滤，用CC14 洗涤沉淀，将滤液合并，加CC14 萃取2 次(2 m L / 次），取下层CC14 用蒸馏水萃取，取有机相转入三角瓶，用无水硫酸钠干燥，过夜。次日滤，用氮气将滤液吹干，得棕色油状物，即为氨基-对硫磷。
       ② 氨基-对硫磷- B S A 的合成：
       a )取氨基-对硫磷（105 m g ，0. 4 m m o l )溶于含2 m m o l盐酸的50 m L 蒸馏水中，在冰盐浴中冷却，搅拌，逐滴缓慢加人冷的0. 1 m o l / L亚硝酸钠，直至无色淀粉-碘化钾试纸变蓝，再换成冰浴，继续搅拌30 m i n后，再加入适量尿素。
       b ) 称取BSA500 m g溶于硼酸盐缓冲液(P H = 9 )中，将a)溶液慢慢加人该溶液中，边加边搅拌，再冰浴搅拌2 h ，反应液逐渐呈橙色透明状，此反应液在4 °C下用PBS透析4 天，透析产物为氨基-对硫磷-BSA免疫抗原，一20 °C低温保存。
        ③免疫抗原的鉴定。估算偶联物中被偶联的2 种分子的比率(偶联比率）的方法，是依据检测偶联物中被偶联的2 种分子含量(或相对含量）。用紫外分光光度计法测定免疫抗原中B S A 的浓度。将对硫磷- B S A偶联物溶液稀释至光密度值为0. 2〜2. 0,在波长260 n m 和280 n m处，分别测出光密度值( 0 0 26。„„和O D 28。„_» )，然后算出免疫抗原的浓度：蛋白质浓度( m g / m L ) = 1. 4 5 0 D 280 nm-0. 7 4 O A 60„m 。取对硫磷溶液（0. 5 m g / m L ) ，B S A 溶液（0. 5 m g /m L ) 和免疫抗原（相当于0.5 m g / m L 蛋白），以P B S 为空白对照，在紫外可见分光光度计上扫描其吸收光谱线。用定磷法测定对硫磷- B S A偶联物中磷的浓度，确定结合比。方法如下:取1 m L 的免疫抗原放入开氏烧瓶，加入5.0 m L H 2S 0 4、1.5 m L H 20 2，摇匀，过夜。然后在电炉上加热，升温至H 2S〇4 冒烟，稍冷后加1 5滴H 20 2，摇动，再加热10 m i n ,稍冷后分次加5〜10滴H 20 2，分次消煮至不冒烟，将消煮液移人100 m L 容量瓶中，加水定容，备用。

        同一实验做2 个平行测定。吸取磷标准溶液0. 00,1. 00,2. 00,3. 00,4. 00，5. 00,6. 00 m L分别置于7个50 m L 容量瓶中，加人与试样溶液等体积的空白溶液,加水至30 m L 左右，加2 滴2，4-二硝基酚指示剂溶液，用1 0 % 氢氧化钠溶液5 % H 2S 0 4 溶液调节溶液呈微黄色，加10.0 m L 钼酸铵试剂，摇匀，用水定容，此溶液为1 m L 含磷（P ) 0 . 0 0，1. 00,2. 00,3. 0 0，4. 00,5.00,6.00 y g 的标准溶液系列，在室温下15 ° C 以上条件下放置20 m i n后（最长不超过4 h)在分光光度计波长440 n m 处以空白溶液调点，进行比色，读取吸光度。根据磷浓度和吸光度绘制标准曲线。吸取5. 00 m L 〜10. 00 m L 试样溶液于50 m L 容量瓶中，加水至30 m L 左右，与标准溶液同条件显色，比色读取吸光度，可以计算最终的磷含量。
        ④酶标半抗原及包被抗原的制备。酶标半抗原及包被抗原的联接方法与上面的免疫抗原制备方法相同，只是把载体蛋白B S A 改为辣根过氧化物酶和O V A 。检测血清效价时采用的是间接酶联吸附法，包被抗原为对硫磷- O V A 。